骆清铭院士和龚辉教授带领MOST团队发明的显微光学切片断层成像系列技术（MOST/fMOST）作为介观尺度最精准的三维完整器官成像技术，已在神经机制、脑疾病、心脑血管疾病以及药理毒理等科学前沿领域研究中发挥重要作用，并带动了相关标记技术和大数据处理和解析技术的发展。
文章题目：Subregion preference in the long-range connectome of pyramidal neurons in the medial prefrontal cortex
发表时间：2024年4月29日
发表期刊：BMC Biology
研究团队：华中科技大学武汉国家光电实验室、苏州脑空间信息研究院、海南大学
大脑的mPFC分为前扣带区（PL）、中扣带区（ILA）和前扣带皮层（ACA），在认知功能和情感行为中发挥着重要作用。研究表明，虽然PL和ILA在工作记忆、决策、情绪调节和社会行为中都起重要作用，但从某种角度来说其功能相反。例如，PL与恐惧记忆的形成更相关，而ILA则与恐惧记忆的消退更相关。此外，研究称PL的激活会产生类似焦虑的行为，而ILA的激活则没有这种效果。大脑内侧前额叶皮层 (mPFC) 功能是非常复杂的，包含多个不同亚区的多种类型神经元，每个亚区有其特定的功能偏好。锥体神经元具有广泛的投射，投射到同侧皮层亚区，并具有亚区偏好。
2024年4月29日，华中科技大学武汉国家光电实验室、苏州脑空间信息研究院、海南大学研究团队在 BMC Biology 期刊发表了题为“Medial Prefrontal Cortex Pyramidal Neurons Show Subregion Preference in Long-Range Connectome”的研究论文，结合病毒示踪和荧光显微光学切片断层成像（fMOST）技术，在两种转基因Cre小鼠中系统性地解析了mPFC亚区的IT和PT神经元的全脑连接组图谱，为理解其功能多样性提供了新视角。
图1：（A）实验方案：病毒示踪、fMOST全脑成像、数据预处理与分析。四个注射位点：前PL（蓝色）、中PL（黄色）、后PL（紫色）和ILA（青色）。（B）IT和PT神经元神经元的全脑输入和输出图谱。（C）mPFC全脑输入输出的定量统计
该研究使用了成年Plxnd1-2A-CreER和Fezf2-2A-CreER转基因小鼠进行实验。为了研究全脑输入分布，先将AAV辅助病毒AAV-DIO-RG和AAV-DIO-TVA-mCherry注射到每个目标脑区(图1A)。病毒注射三天后用他莫昔芬 (TM,20mg/kg)进行诱导，3周后在同一部位注射RV病毒RV-EnvA-△G-eGFP，病毒表达1周后，动物灌流取材。
对于全脑输出研究，先将AAV-DIO-GFP病毒注射到目标大脑区域。TM也于第三天进行诱导，病毒注射三周后动物灌流取材。被病毒标记的鼠脑经过树脂塑性包埋，通过fMOST系统对样品进行连续成像。接下来，通过Neuro-GPS在全脑水平上对输入神经元的胞体和输出轴突纤维的像素点进行定量统计,统计结果利用DeepMapi与标准的Allen脑图谱进行配准。
通过fMOST技术，我们发现mPFC的输入神经元主要分布在同侧皮层和丘脑，输入神经元表现出外-内分布模式，特别是在Fezf2输入中，外侧为aPL，内侧为mPL、pPL、ILA按顺序在同侧皮层输入，丘脑的输入则相反(图1B)。为了了解全脑连接的情况，输入和输出区域被划分为12个更大的区域(图1C)。除了皮层和丘脑，mPFC还接收到来自嗅觉、海马、皮层底板、纹状体、苍白球和下丘脑的输入。
对于全脑输出，四个mPFC区域的投射路径呈现相对空间分离的模式(图1B)。对于全脑输出追踪，Fezf2神经元主要投射到同侧皮质下脑区，包括纹状体，丘脑，下丘脑，中脑和后脑，而Plxnd1神经元主要投射到同侧和对侧相邻的额叶皮层和纹状体。Plxnd1输出纤维分布呈镜像对称分布，在对侧和同侧分布密度非常相似(图1B,C)。
图2：mPFC亚区域的连接示意图。A、B用Spearman相关矩阵和层次聚类表示Fezf2 (A)和Plxnd1 (B)的输入脑区比例差异分布情况。红色，正相关;蓝色为负相关。（C）不同mPFC亚区空间差异性分布示意图。a,前;p,后;d,背;v,腹侧;m,内侧;l,外侧。
为了解mPFC的全脑连接分布情况，更好地展示全脑输入的比例差异，该研究从Fezf2和Plxnd1输入表达细胞核进行了相关性和层次聚类分析(图2A, B)。结果发现，与PL相比，细胞核偏好投射于ILA，这类细胞核被重新整合成一个大的类别，包括MS, ACAv, AM, CA1, SUB, NDB，RSP, RE, AD和ENTl，很多这些脑区都是与情景记忆或空间记忆有关的。投射于PL的细胞核也被分组，其中许多是与运动有关的，比如MOs，MOp、VAL、VM和GPe。这些结果表明PL和ILA可能参与不同的功能。最后，该研究总结了mPFC亚区细胞核空间分布差异(图2C)。其中，pPL和ILA从前AM、腹侧PT、前鼻侧和外侧MD以及后内侧BLAa接收输入和输出的更多。此外，aPL和mPL投射到PAG腹侧，aPL优先投射到DP核腹侧、ACB外侧，CP核腹外侧。
综上所述，研究人员利用病毒示踪和fMOST成像技术，详细分析了两种主要兴奋性神经元在mPFC不同亚区输入和输出的分布，获得了四个亚区分区域偏好的全脑连接组图谱，并确定了从aPL到ILA输入模式的连续变化，促进了mPFC不同亚区功能性研究的发展。